潍坊环评-水质粪大肠菌群测定光度法
时间：2020-04-18
1 范围
本标准规定了测定水中粪大肠菌群的分光光度法和荧光法。
本标准适用于地表水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的应急现场快速测定。
本方法的检出限为30 MPN/L，检测范围：30～10 9 MPN/L，检测周期不大于18 h。
2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导
HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范
HJ 494 水质 采样技术指导
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 粪大肠菌群 fecal coliforms 44.5 ℃培养能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
3.2 最大可能数 most probable number，MPN 最大可能数（most probable number，缩写为MPN），又称稀释培养计数，
是一种基于泊松分布的 间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，
查表 估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。
4 分光光度法 4.1 方法原理 一定量的水样与选择性培养基混合均匀放置于44.5 ℃环境下，
粪大肠菌群产生β-半乳糖苷酶（β -D-galactosidase），并分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，
通过连续分光光度（波长： 300 nm～600 nm）测定，依据待测水样色度变化与水中粪大肠菌群数成一定关系的原理，
得出粪大肠菌 群浓度。 4.2 干扰和消除 DB37/T 3787－2019 2 4.2.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，
导致细胞死亡，可在样品采集（4.5.1）时 加入硫代硫酸钠溶液（4.3.4）消除干扰。
4.2.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（4.5.1） 时加入
乙二胺四乙酸二钠溶液（4.3.5）消除干扰。 4.3 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。
4.3.1 粪大肠菌群检测试剂主要成分： ——蛋白胨：5 g； ——硫酸锰：0.005 g； ——硫酸镁：0.001 g；
——硫酸锌：0.001 g； ——磷酸盐：1.78 g； ——两性霉素 B：0.60 g； ——蒸馏水 1 000 mL。
制法：上述试剂溶于蒸馏水中，充分混匀，调整pH值为7.2～7.4，68.95 kPa(115 ℃)，高压灭菌 20 min，分装贮存于4 ℃避光备用。
注：也可采用市售商品化培养基制品。
4.3.2 硫代硫酸钠（Na2S2O3•5H2O）。
4.3.3 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2•2H2O）。
4.3.4 硫代硫酸钠溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10 g/mL，称取 15.7 g 硫代硫酸钠（4.3.2），溶于适量水 中，定容至 100 mL，临用现配。
4.3.5 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：ρ（C10H14N2O8Na2•2H2O）=0.15 g/mL，称取 15 g 乙二胺四 乙酸二钠（4.3.3），溶于适量水中，定容至 100 mL，此溶液保质期为 30 d。
4.3.6 无菌水：取适量纯水，经 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min，备用。 4.4 仪器和设备 4.4.1 采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的 100 mL、250 mL、500 mL 广口玻璃瓶。
注：在采集不存在或不考虑余氧、金属离子干扰的样品时，可采用市售无菌采样瓶或无菌采样袋。
4.4.2 微生物快速检测仪： ——恒温培养单元：不少于 2 个温控系统，温度控制精度 1 ℃，可自动调节待检测样本培养温度 （44.5 ℃±1 ℃）；
——检测单元：不少于 4 个独立的检测系统，可实现多个样本的同时监测； ——数据显示、处理单元：自动输出检测结果，可查询和显示历史数据。
4.4.3 高压蒸汽灭菌器：121 ℃可调、101.3 kpa。 4.4.4 量筒：50 mL、100 mL。 4.4.5 移液管：1 mL、10 mL。
4.4.6 天平：感量 0.01 g。 注：移液管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具试验前应按无菌操作要求包扎，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，烘干，备 用。
4.5 样品 4.5.1 样品采集 DB37/T 3787－2019 3 点位布设及采样频次按照GB/T 14581、HJ 494和HJ/T 91的相关规定执行。 与其它项目一同采样时，
先单独采集微生物样品，采样瓶（4.4.1）不得用水样洗涤，采集水样于 灭菌的采样瓶中。 采集河流、湖库等地表水样时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，
约距水面10 cm～15 cm 处，瓶口朝水流方向，拔玻璃塞，使水样灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，
可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的80%左右。采好水样后，迅速扎上无菌包装纸。 采集地表水、废水样品及一定深度的水样时，
可使用灭菌过后专用采样装置采样。 在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，避免不同层次的搅扰。
如果采集的是含有活性氯的样品时，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（4.3.4），以除去活 性氯对细菌的抑制作用(每125 mL容积加入0.1 mL的硫代硫酸钠溶液)；
如果采集的是重金属离子含量较 高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（4.3.5），以消除干扰（每125 mL容积加入0.3 mL的乙二胺四乙酸二钠溶液）。
注：15.7 mg硫代硫酸钠(4.3.2)可去除样品中1.5 mg活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。
4.5.2 样品保存 采样后应在2 h内检测，否则，应10 ℃以下冷藏但不得超过6 h。实验室接样后，不能立即开展检 测的，将样品于4 ℃以下冷藏并在2 h内检测。
4.6 分析步聚 4.6.1 接种 接种待测水样于装有5 mL培养基的检测瓶中，定容至20 mL，水样与培养基应充分混匀。
4.6.2 培养 打开仪器电源开关，待仪器稳定30 min后，将接种后的检测瓶放置于微生物快速检测仪中，按照仪 器说明书进行操作，设置检测温度为44.5 ℃，点击“检测”按钮，2～18小时，仪器自动培养得出结果。
4.6.3 对照试验 4.6.3.1 空白对照 采用无菌水（4.3.6）作为待测水样按照本标准4.6.1～4.6.2进行空白测定，测试结果不得检出， 否则该次样品测定结果无效，应重新测定空白以及待测样品。
本标准规定了测定水中粪大肠菌群的分光光度法和荧光法。
本标准适用于地表水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的应急现场快速测定。
本方法的检出限为30 MPN/L，检测范围：30～10 9 MPN/L，检测周期不大于18 h。
2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导
HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范
HJ 494 水质 采样技术指导
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 粪大肠菌群 fecal coliforms 44.5 ℃培养能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
3.2 最大可能数 most probable number，MPN 最大可能数（most probable number，缩写为MPN），又称稀释培养计数，
是一种基于泊松分布的 间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，
查表 估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。
4 分光光度法 4.1 方法原理 一定量的水样与选择性培养基混合均匀放置于44.5 ℃环境下，
粪大肠菌群产生β-半乳糖苷酶（β -D-galactosidase），并分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，
通过连续分光光度（波长： 300 nm～600 nm）测定，依据待测水样色度变化与水中粪大肠菌群数成一定关系的原理，
得出粪大肠菌 群浓度。 4.2 干扰和消除 DB37/T 3787－2019 2 4.2.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，
导致细胞死亡，可在样品采集（4.5.1）时 加入硫代硫酸钠溶液（4.3.4）消除干扰。
4.2.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（4.5.1） 时加入
乙二胺四乙酸二钠溶液（4.3.5）消除干扰。 4.3 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。
4.3.1 粪大肠菌群检测试剂主要成分： ——蛋白胨：5 g； ——硫酸锰：0.005 g； ——硫酸镁：0.001 g；
——硫酸锌：0.001 g； ——磷酸盐：1.78 g； ——两性霉素 B：0.60 g； ——蒸馏水 1 000 mL。
制法：上述试剂溶于蒸馏水中，充分混匀，调整pH值为7.2～7.4，68.95 kPa(115 ℃)，高压灭菌 20 min，分装贮存于4 ℃避光备用。
注：也可采用市售商品化培养基制品。
4.3.2 硫代硫酸钠（Na2S2O3•5H2O）。
4.3.3 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2•2H2O）。
4.3.4 硫代硫酸钠溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10 g/mL，称取 15.7 g 硫代硫酸钠（4.3.2），溶于适量水 中，定容至 100 mL，临用现配。
4.3.5 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：ρ（C10H14N2O8Na2•2H2O）=0.15 g/mL，称取 15 g 乙二胺四 乙酸二钠（4.3.3），溶于适量水中，定容至 100 mL，此溶液保质期为 30 d。
4.3.6 无菌水：取适量纯水，经 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min，备用。 4.4 仪器和设备 4.4.1 采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的 100 mL、250 mL、500 mL 广口玻璃瓶。
注：在采集不存在或不考虑余氧、金属离子干扰的样品时，可采用市售无菌采样瓶或无菌采样袋。
4.4.2 微生物快速检测仪： ——恒温培养单元：不少于 2 个温控系统，温度控制精度 1 ℃，可自动调节待检测样本培养温度 （44.5 ℃±1 ℃）；
——检测单元：不少于 4 个独立的检测系统，可实现多个样本的同时监测； ——数据显示、处理单元：自动输出检测结果，可查询和显示历史数据。
4.4.3 高压蒸汽灭菌器：121 ℃可调、101.3 kpa。 4.4.4 量筒：50 mL、100 mL。 4.4.5 移液管：1 mL、10 mL。
4.4.6 天平：感量 0.01 g。 注：移液管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具试验前应按无菌操作要求包扎，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，烘干，备 用。
4.5 样品 4.5.1 样品采集 DB37/T 3787－2019 3 点位布设及采样频次按照GB/T 14581、HJ 494和HJ/T 91的相关规定执行。 与其它项目一同采样时，
先单独采集微生物样品，采样瓶（4.4.1）不得用水样洗涤，采集水样于 灭菌的采样瓶中。 采集河流、湖库等地表水样时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，
约距水面10 cm～15 cm 处，瓶口朝水流方向，拔玻璃塞，使水样灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，
可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的80%左右。采好水样后，迅速扎上无菌包装纸。 采集地表水、废水样品及一定深度的水样时，
可使用灭菌过后专用采样装置采样。 在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，避免不同层次的搅扰。
如果采集的是含有活性氯的样品时，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（4.3.4），以除去活 性氯对细菌的抑制作用(每125 mL容积加入0.1 mL的硫代硫酸钠溶液)；
如果采集的是重金属离子含量较 高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（4.3.5），以消除干扰（每125 mL容积加入0.3 mL的乙二胺四乙酸二钠溶液）。
注：15.7 mg硫代硫酸钠(4.3.2)可去除样品中1.5 mg活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。
4.5.2 样品保存 采样后应在2 h内检测，否则，应10 ℃以下冷藏但不得超过6 h。实验室接样后，不能立即开展检 测的，将样品于4 ℃以下冷藏并在2 h内检测。
4.6 分析步聚 4.6.1 接种 接种待测水样于装有5 mL培养基的检测瓶中，定容至20 mL，水样与培养基应充分混匀。
4.6.2 培养 打开仪器电源开关，待仪器稳定30 min后，将接种后的检测瓶放置于微生物快速检测仪中，按照仪 器说明书进行操作，设置检测温度为44.5 ℃，点击“检测”按钮，2～18小时，仪器自动培养得出结果。
4.6.3 对照试验 4.6.3.1 空白对照 采用无菌水（4.3.6）作为待测水样按照本标准4.6.1～4.6.2进行空白测定，测试结果不得检出， 否则该次样品测定结果无效，应重新测定空白以及待测样品。
